IPS诱导肠类器官的培养可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、以及类器官的培养。本文将重点介绍第二阶段—内胚层分化及中/后肠模式化诱导。

一、前期准备

1. 试剂与设备

- 细胞：H1/H9 hESC或患者来源的iPSCs。

- 培养基：人多能干细胞培养基(abs9403)与RPMI1640(abs9484)。

- 消化液：人多能干细胞消化液(abs9409)。

- 培养基添加剂：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)(abs9295)及双抗(abs9244)。

- 生长因子：ActivinA(100ng/mL)(abs05801)、FGF4(500ng/mL)(abs06269)、WNT3a(500ng/mL)(abs05632)。

- 基质胶：即用型基质胶（培养板包被）(abs9410)及类器官专用基质胶(abs9495)。

- 血清：透析胎牛血清(abs945)。

- 关键设备：表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀、预冷微量离心管。

2. 试剂配制

- 内胚层分化培养基：

  Day 1：RPMI1640 + L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM) + 双抗(1%) + ActivinA(100ng/mL)。

  Day 2：在Day 1的基础上添加透析胎牛血清(0.2%)。

  Day 3：在Day 1的基础上添加透析胎牛血清(2%)。

- 中/后肠分化培养基：

  RPMI1640 + 透析胎牛血清(2%) + FGF4(500ng/mL) + WNT3a(500ng/mL)。

二、hPSCs传代与铺板

1. 细胞传代（耗时约2小时）

- 使用人多能干细胞消化液处理hPSCs直至边缘卷起。

- 用细胞刮刀轻轻剥离细胞团，反复吹打至1-2mm大小的细胞团。

- 按1:6比例将细胞接种至Matrigel包被的24孔板（每孔约5000个细胞团）。

- 轻敲培养板以使细胞均匀分布，并在37°C下过夜培养。

2. 细胞扩增至85-90%融合（约3-4天）

- 每日更换人多能干细胞培养基，并观察细胞密度。

- 关键：如细胞密度过高（可能导致自发分化）或过低（影响分化效率），需重新铺板。

三、内胚层分化（3天）

1. Day 1

更换为Day 1内胚层培养基（无血清），培养24小时。

2. Day 2

更换为Day 2内胚层培养基（含0.2%透析胎牛血清），培养24小时。

3. Day 3

更换为Day 3内胚层培养基（含2%透析胎牛血清），培养24小时。

4. 验证分化效率（可选）

- 通过免疫染色检测FOXA2/SOX17双阳性细胞，预计效率应达到85-90%。

四、中/后肠模式化（3-4天）

1. 诱导球状体形成

- 吸除内胚层培养基，加入中/后肠分化培养基，保持每日更换。

- 48小时后，通过立体显微镜观察上皮增厚。72-96小时后，球状体(spheroids)会从单层细胞中脱离。

2. 收集球状体

- 使用200μL枪头收集游离的球状体，每管约50个，置于冰上备用。

在此阶段的实验中，我们推荐以下产品，以支持您的研究工作与实验需求：人生就是博，我们将为您提供卓越的实验室产品和服务。请查看相关货号及品名，以满足您的实验需求。

• abs9403 人多能干细胞培养基 500ml
• abs9409 人多能干细胞消化液 100mL
• abs9295 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（100×，200mM） 100mL
• 更多产品信息请联系 人生就是博 - 让我们一起探索生物医学的未来！